背景偏高,靈敏度偏低何解?

    ELISA實(shí)驗(yàn)中，常見的背景偏高，靈敏度偏低問題，造成的原因有很多，我司技術(shù)人員就此給大家總結(jié)歸納如下：

背景偏高問題

原因一：孔洗滌不充分
解決方案：按照實(shí)驗(yàn)方案建議進(jìn)行洗滌。

原因二：洗滌緩沖液污染
解決方案：制備新鮮的洗滌緩沖液。

原因三：檢測試劑過多
解決方案：確保試劑被正確稀釋或者減少檢測試劑的推薦濃度。

原因四：封閉緩沖液無效（例如檢測試劑結(jié)合封閉劑；孔未*封閉）
解決方案：嘗試不同的封閉劑和/或?qū)⒎忾]劑添加到洗滌緩沖液。

原因五：孵育/洗滌緩沖液的鹽濃度
解決方案：增加鹽濃度可能會降低非特異性和/或減弱脫靶相互作用。

原因六：讀板前加入終止液后時(shí)間太長
解決方案：添加終止液后立即讀板。

原因七：抗體出現(xiàn)非特異性結(jié)合
解決方案：使用適當(dāng)?shù)姆忾]緩沖液，例如 BSA 或 5-10% 正常血清，如果是直標(biāo)一抗，使用與一抗種屬相同的血清，如果是非直標(biāo)一抗，則使用與二抗種屬相同的血清。確保孔已經(jīng)過預(yù)處理，以防止非特異性附著。

原因八：高抗體濃度
解決方案：嘗試不同的稀釋度，以獲得*結(jié)果。

原因九：底物孵育在光下進(jìn)行
解決方案：底物孵育應(yīng)避光進(jìn)行，或根據(jù)試劑的實(shí)驗(yàn)方案建議進(jìn)行。

底物加入后孔中有沉淀生成
解決方案：增大樣品的稀釋倍數(shù)或降低底物濃度。

孔板臟
解決方案：清潔孔板底部。

靈敏度偏低問題

原因一：ELISA試劑盒保存不當(dāng)
解決方案：按推薦方式保存所有試劑。請注意，各試劑的保存條件可能有所不同。

原因二：靶標(biāo)不足
解決方案：濃縮樣品或降低樣品稀釋度。

原因三：檢測試劑失活
解決方案：確保報(bào)告酶/熒光素具有預(yù)期的活性。

原因四：酶標(biāo)儀設(shè)置不正確
解決方案：在檢測中，確保酶標(biāo)儀設(shè)置為正確的吸收波長或激發(fā)/發(fā)射波長。

原因五：測定方法不夠靈敏
解決方案：更換更靈敏的檢測系統(tǒng)（例如從比色檢測轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)發(fā)光/熒光檢測）。更換更靈敏的測定方法（例如從直接 ELISA 方法轉(zhuǎn)變?yōu)閵A心 ELISA 方法）。延長孵育時(shí)間或升高溫度。

原因六：微量滴定板吸附靶標(biāo)的效果不佳
解決方案：將靶標(biāo)共價(jià)結(jié)合到微量滴定板。

原因七：底物不足
解決方案：加入更多底物。

原因八：樣品類型不兼容（例如血清與細(xì)胞提取物）
解決方案：對于沒有驗(yàn)證過的樣品種屬，檢測信號可能減弱或沒有。使用驗(yàn)證過的樣品類型作為陽性對照同時(shí)進(jìn)行檢測。

原因九：緩沖液或樣品成分干擾
解決方案：確認(rèn)試劑中是否存在干擾性化合物。例如，抗體中的（die）（dan）hua鈉會抑制 HRP 酶，在血漿中用作抗凝劑的 EDTA 會抑制酶反應(yīng)。

原因十：混合或混用不同試劑盒的試劑
解決方案：避免混合來自不同試劑盒的試劑。