你們細胞是怎么凍存的?求解!!!我的是4度冰箱放半小時,-20度冰箱半小時,然后轉移到-80度冰箱!但是放在-80度冰箱1個月后,細胞復蘇就感覺狀態不太好了!!
做實驗前要先學會凍存，以備自己在后面的實驗中能保持同一來源、穩定可靠的細胞，且可減少污染或其它不利影響。
1、影響凍存細胞活性的因素
（1）細胞凍存保護劑：常用的有二甲基亞砜（DMSO）和甘油，常用的濃度為5%-10%（90%小牛血清）。DMSO對二倍體細胞的毒性較甘油小。
（2）細胞懸液的凍結速度：慢凍時冰凍在細胞外形成，因此不致損害細胞。多數細胞以每分鐘下降1℃的速度，降至-20℃凍結。均可獲得滿意效果。
（3）保存溫度：液氮罐，可達到-196℃，此時所有的物理化學活動均降至zui低限度，以保證細胞長期保存。
（4）復蘇：急速融化復蘇可防止損害細胞。凍結細胞從液氮中取出后，應立即放入37℃~43℃的水浴中，30秒至一分鐘內融化。
了解了影響凍存的因素，上海恒遠生物在為您解析八大要素，用于保存細胞株。歡迎閱讀參考。
1. 紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態，用酒精消毒操作者的雙手。
2. 將所需的培養基，胰酶確保瓶身干凈后放于工作臺面內，點燃酒精燈，將培養基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側。特別是將培養基瓶放于斜架上，瓶口對準酒精燈，且放在距離酒精燈zui近的位置，瓶蓋置于酒精燈的另一側。
3. 將培養瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，蓋放于酒精燈右側后將培養瓶內的培養液懸空倒進污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，豎直放好。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1.5ml胰酶液，懸空移入培養瓶內。
4. 將培養使胰酶浸沒整個瓶壁的細胞層，計時約40s，立馬豎起對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個細胞脫落，這時為胰酶消化的zui適時機。若看到成片的細胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；若看不到針孔樣縫隙和細胞脫落，則需繼續消化，輕輕的迅速平放培養瓶使胰酶浸沒細胞層1s后迅速豎起對著燈光觀察細胞情況，可反復幾次，直至出現針孔樣縫隙和1-2個細胞脫落的*消化狀態。用移液器將胰酶吸凈。
5. 吸取1ml細胞凍存液于培養瓶內，并用移液器吸取少量的培養基輕柔的反復沖洗培養瓶壁5-8次，使貼壁細胞*脫落于培養基內再輕輕吹打2-3次，使細胞盡可能處于單個懸浮狀態。
6. 將1ml含有細胞的凍存液移入新的保種管內，擰緊瓶蓋，做好實驗標記。
7. 將培養基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。
8. 將保種管先放于4℃冰箱 30min后拿出放置-20℃冰箱過一夜，次日再放于-80℃的冰箱內3-4天，zui后存放于-196℃的液氮灌內長期保存。
注此過程也可簡化因實際操作過程中經驗所得：步驟7結束后將保種管用干脫脂棉包裹后膠帶封好直接放于-80℃冰箱內4-5天，即可放于液氮灌保存。但-80℃冰箱也可保存細胞株2-3月。
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